一、分光光度計的原理 分光光度計使用一個可以產(chǎn)生多種波長的光源，通過一系列分光計產(chǎn)生特定波長的光源。光源通過被測樣品后，部分光源被吸收，計算出樣品的光吸收值，從而換算成樣品的濃度。樣品的吸光度與樣品的濃度成正比。用分光光度計測量的樣品必須是均勻的溶液，不能有沉淀。如有沉淀，應(yīng)搖勻。

　　1.關(guān)系式

　　光通過被測物質(zhì)的溶液時，被物質(zhì)吸收的量與物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光程長度)成正比，關(guān)系如下:A=-lg(I/I)。)=-lgT=kLc其中:a為吸光度； 2.基本原則 我.是入射單色光的強(qiáng)度；I是透射的單色光強(qiáng)度；t是物質(zhì)的透射比；k是摩爾吸收系數(shù)；l為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長c為物質(zhì)的濃度，物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，對應(yīng)的吸收系數(shù)為物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)某一純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)已知時，可以將樣品在相同條件下配制成溶液，測定其吸收，這樣就可以通過上式計算出樣品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除了一些吸收光的物質(zhì)外，許多物質(zhì)本身是不吸收光的，但在一定條件下加入顯色劑或處理使其顯色后可以測定， 所以也叫比色分析。由于影響顯色深度的因素很多，且經(jīng)常使用單色光純度差的儀器，因此在測定時應(yīng)同時使用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌贰?/p>

　　二、實(shí)際應(yīng)用操作

　　分光光度計是用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量和定性分析的儀器。另一方面，分光光度法通過測量物質(zhì)在特定波長或一定波長范圍內(nèi)的光吸收，對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。常用的波長范圍有:

　　(1)200 ~ 400納米的紫外區(qū)。

　　(2)400 ~ 760納米的可見光區(qū)。

　　(3)2.5 ~ 25微米的紅外區(qū)(以波數(shù)計為4000厘米-1 ~ 400厘米-1)。

　　使用的儀器有紫外分光光度計、可見分光光度計(或色度計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精度和準(zhǔn)確度，所有儀器應(yīng)按照國家計量檢定規(guī)程或本附錄的規(guī)定進(jìn)行定期校準(zhǔn)。單色光輻射通過被測物質(zhì)的溶液時，被物質(zhì)吸收的量與物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光程長度)成正比，關(guān)系如下:1 a = log-= ECLT其中a為吸光度；t是透光率；e為吸收系數(shù)，用(E1% 1cm)表示，即吸收換算成溶液濃度為1% (g/ml)，液層厚度為1cm的數(shù)值； c為100ml溶液中所含被測物質(zhì)的重量，g(以干品或無水物質(zhì)計算)；l是液體層的厚度，厘米。光的選擇性吸收波長和相應(yīng)的吸收系數(shù)是材料的物理常數(shù)。當(dāng)某一純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)已知時，可以將樣品在相同條件下配制成溶液，測定其吸收，這樣就可以通過上式計算出樣品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，許多物質(zhì)本身除部分外不吸光，但可通過加入顯色劑或在一定條件下處理后進(jìn)行測定，故又稱為比色分析。由于影響顯色深度的因素很多，且經(jīng)常使用單色光純度差的儀器，因此， 測定時應(yīng)同時使用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌贰?

　　總結(jié):

　　分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗室的常規(guī)儀器。它通常用于核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)菌生長濃度的定量。分光光度計使用一個可以產(chǎn)生多種波長的光源，通過一系列分光計，產(chǎn)生特定波長的光源。光線通過被測樣品后，部分光線被吸收，計算出樣品的吸收值，換算成樣品的濃度。樣品的吸光度與樣品的濃度成正比。

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